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Cultivo e Identificación de Larvas Infectantes de Nematodes Gastrointestinales del Bovino y Ovino. Román Niec DMV

Instituto de Patología Animal, Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Secretaría de Estado de Agricultura y Ganadería de la Nación, República Argentina

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3. Cultivo de larvas de nematodes gastrointestinales.

Existen varios métodos de cultivo de larvas, partiendo de huevos de nematodes, que se encuentran en calidad y cantidad variable en las heces, o a partir de huevos obtenidos de hembras maduras de parásitos.
Todos los métodos se basan sobre los mismos principios: permitir que maduren y eclosionen los huevos de nematodes y que desarrollen las larvas, gracias a condiciones favorables, evolucionando hasta larvas bifectantes.
El éxito del cultivo depende de tres factores: humedad, temperatura adecuada y oxigenación. Las materias fecales demasiado secas deben humedecerse, las demasiado húmedas o diarreicas deben consolidarse. Como materia consolidante se puede usar: carbón vegetal, musgo estéril, o materia fecal bovina u ovina previamente desecada, esterilizada  a 140-150° C y posteriormente pulverizada. Es necesario comprobar la

esterilidad de este material, sometiéndolo a cultivo. El agua para cultivos, puede ser esterilizada o de canilla, pero sin rastros de cloro, cuya presencia mata a las larvas de primer y segundo estado. El agua proveniente de tanques debe ser examinada por la posible presencia de nematodes de vida libre y en tal caso, hervida y filtrada.
Comparando varios sistemas de cultivo, hemos adoptado el método de Corticelli y Lai (1963), el cual es una modificación del de Roberts y O'Sullivan (1950).
El procedimiento de Corticelli y Lai consiste en el uso de dos cajas de Petri. Una de tamaño corriente (10 cm de diámetro) que contiene el material en cultivo y va colocada dentro de otra mayor (15 cm de diámetro) con agua a altura de 1 cm, aproximadamente. La caja menor va sin tapa, la grande tapada. Así formada una "cámara húmeda" con el cultivo, se coloca en estufa oscurecida, a temperatura de 24-27° C durante 7-8 días, o en temperatura ambiente (10-15° C) durante diez días. Diariamente se destapa la caja grande durante 1-2 horas para airear el cultivo. Hemos observado que variaciones de temperatura (3-4° C) parecen favorecer el cultivo, más bien que la temperatura constante. Transcurridos 8-10 días, se invierte la caja chica con cultivo dentro de la grande y se deja más o menos doce horas, término durante el cual la mayoría de las larvas pasan al agua. Por sedimentación y/o centrifugación se concentran las larvas. Observamos que con este método se recupera un mayor porcentaje de larvas y además se obtiene una suspensión de ellas más limpia, libre de partículas orgánicas y de tierra.
En el término de 10 días, evolucionan casi todas las larvas infectantes de nematodes gastrointestinales, con excepción de las de Nematodirus spp., que necesitan más tiempo, variable según la especie.

En el género Nematodirus la evolución larval desde L 1 hasta L 3, tiene lugar dentro del huevo de parásito.
Tomando en cuenta las condiciones de evolución y eclosión podemos dividir a las cuatro especies de Nemalodirus: helvetianus, spathiger, filicollis y battus, en dos grupos:
1) Nematodirus helvetianus y N. spathiger, los dos cultivan entre 22-24° C, llegando a L3; el primero comienza a eclosionar a los ±L 10 días; el segundo a partir de los 14-15 días, ambos en forma espontánea. 
2) Nematodirus filicollis y N. battus, cultivan en ± 27-30 días entre 22-24° C. Las dos especies necesitan para eclosionar un estímulo, sea mecánico o térmico. El estímulo mecánico se logra en el laboratorio sacudiendo la suspensión con huevos larvados, mediante perlas de vidrio de 3-4 mm de diámetro. El térmico, sometiendo el cultivo a temperaturas mayores (36-38° C) o mediante un cambio brusco alternado, -2° C y 21° C. De ambas maneras se logra la eclosión de las larvas infectantes incluidas en los huevos.
En la práctica, si nos interesa obtener cultivos de larvas de Nemalodirus spp., una vez recuperadas las larvas de nematodes (a los 8-10 días de cultivo), se deja nuevamente el material en estufa unos veinte días más; por último se aplica el estímulo (térmico o mecánico) para provocar la eclosión de las larvas.

 

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