RED DE HELMINTOLOGIA PARA AMERICA LATINA Y EL CARIBE
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Diagnostico de
Trichinella spiralis
por el Metodo de
Digestion Artificial
OCTUBRE 1997
Gustavo Montali / Médico Veterinario
Marta Cabral / Bacterióloga
Hugo Plaza / Técnico de Laboratorio
Dirección de Desarrollo Agropecuario y Sanidad Animal
¿QUE ES LA TRIQUINOSCOPIA?
es un método directo aplicable a muestras de carne fresca que posibilita visualizar el parásito Trichinella spiralis encapsulado.
Permite detectar cargas iguales o mayores a 3 larvas por gramo
¿QUE ES LA DIGESTION ARTIFICIAL?
es un método directo que permite el aislamiento, visualización y cuantificación de larvas de Trichinella spiralis, en trozos de músculo o chacinados elaborados con carne de animales susceptibles de padecer la enfermedad.
¿POR QUE ELEGIMOS LA DIGESTION ARTIFICIAL?
Porque es un método más sensible que detecta cargas iguales o menores a 1 larva por gramo, brindando mayor seguridad. Esta técnica está dirigida especialmente al control de reses porcinas, ya que es en el matadero o en el frigorífico donde estamos frente a la posibilidad de tomar muestras de los músculos de elección, diafragma, base de la lengua y maseteros. En el caso de chacinados, fundamentalmente de aquellos provenientes de brotes, la técnica nos permite confirmar la presencia o no del parásito, teniendo en cuenta que, si la muestra no se encuentra altamente parasitada se deberá llegar al agotamiento total de la pieza, para emitir un resultado certero. Un diagnóstico de ausencia en una determinada cantidad de muestra de chacinado no certifica la ausencia del parásito en el resto de la misma, ni habilita su comercialización.
INDICE
TOMA DE MUESTRA
INSTRUMENTAL / REACTIVOS
Técnica de Digestión con agitador magnético
Cuantificación de larvas por gramo
NOTIFICACION A LA AUTORIDAD
COMPETENTE
TOMA DE MUESTRA
En el cerdo*:
Para tomar la muestra de la res, el músculo de elección es el diafragma, los pilares, en su zona de transición entre la parte muscular y tendinosa. Se deberá tomar como mínimo 50 grs del mismo para permitir más de un análisis si fuere necesario. Si no hubiere o no alcanzare el pilar del diafragma, se deberá tomar parte del diafragma situada cerca de las costillas o del esternón, de la musculatura de la base de la lengua, o de los músculos masticadores.
En cada análisis que se realice se tomará la cantidad mínima de 5 grs de la muestra inicial y se la denominará submuestra.
En el caso que el origen del cerdo sea desconocido o proveniente de un foco se recomienda trabajar con una submuestra de 10 grs
Chacinados*:
Embutidos frescos y secos: Dada la variabilidad de su composición es conveniente analizar 100 grs de muestra provenientes de distintas unidades del lote problema.
Salazones y ahumados: Jamón, bondiola y panceta: Teniendo en cuenta que están elaborados solo con carne porcina analizar 50 grs de muestra. En el caso de jamón crudo, la experiencia demuestra que la zona en donde se encuentra mayor cantidad de larvas es en la zona próxima al garrón.
* Los pesos indicados son los mínimos a fin de obtener resultados confiables. Si se recibieran muestras sospechosas de haber provocado un brote de triquinosis es conveniente que el laboratorio, establezca la cantidad de muestras y el número de digestiones a realizar sobre la misma, a fin de poder proporcionar correctamente un resultado. Se considera como mínima la cantidad indicada anteriormente.
INSTRUMENTAL / REACTIVOS
- Cuchillo y pinzas para la toma de muestras.
- Bandeja dividida en cuadrados que pueda contener las muestras.
- Procesadora de alimentos.
- Agitador magnético con platina térmica de temperatura controlada
y una barra magnética (recubierta con teflón) de 5 cm
- Embudos de separación cónicos (modelo Squibb), capacidad 2 litros.
- Soportes con anillos y fijaciones.
- Tamiz, malla de 170 micrones, diámetro exterior 11 cm con rejilla de acero inoxidable.
- Embudos de un diámetro interior mínimo de 12 cm, destinados a recibir el tamiz.
- Vaso de precipitación de 3 litros.
- Probetas graduadas de una capacidad aproximada de 50 ml
- Triquinoscopio o un estereomicroscopio (aumento 60 x).
- Cubeta para triquinoscopio,con fondo cuadriculado.
- Placas de petri con fondo cuadriculado de 5 cm de diámetro, para el estereomicroscopio.
- Papel de aluminio o film de polietileno.
- Pipetas de 10 ml, 5 ml y 1 ml (1/10).
- Propipetas.
- Termómetro , de 0º C a 60º C.
- Balanza de precisión, sensibilidad 0,1 grs
- Acido clorhídrico fumante (concentración 37%).
- Pepsina, actividad diastásica 1/10.000 N.F. (U.S. National -Formulary); equivalente a 1/ 12500 B.P. /British Pharmacopea) y a 2000 F.I.P. (Federación Internacional de Farmacia).
- Agua destilada templada a 44ºC - 46ºC.
- Solución formulada al 10%, para inactivar el material de vidrio y el líquido de digestión. Los restos sin digerir deberán eliminarse por incineración.
MARCHA METODOLOGICA
Técnica de digestión con agitador magnético:
1. Preparar el líquido de digestión con :
Pepsina y ácido clorhídrico al 1% en agua destilada.
Proporción muestra / líquido de digestión = 1 / 15
Ejemplo: para 10 gr de muestra se necesitan 150 ml de líquido de digestión.
Líquido de digestión:
Pepsina .........................1,5 gr
Acido Clorhídrico .........1,5 ml
Agua Destilada ............150 ml
2. Pesar una submuestra de 10 grs y triturar finamente en la procesadora (tres o cuatro veces, un segundo por vez).
3. Transferir a un vaso de precipitado con capacidad suficiente para la muestra y los 150 ml de líquido de digestión. Colocar la barra magnética, cubrir el vaso con papel de aluminio para evitar salpicaduras y pérdida de temperatura, situarlo sobre la placa precalentada del agitador magnético y comenzar la agitación. La temperatura de la digestión deberá mantenerse entre los 44ºC y 46ºC con una velocidad que permita la formación de un profundo remolino central, pero que no provoque salpicaduras.
4. Agitar la preparación durante 30 minutos si es de carne fresca y si son chacinados secos extender el tiempo de agitación hasta que se produzca la digestión. No deben observarse trozos de carne.
5. Observar que la digestión se halla completado y luego filtrar a través del tamiz colocado en el embudo, (esquema página 9) recogiendo el líquido de digestión en el embudo de separación.
6. Dejar sedimentar por 30 minutos.
7. Abrir rápidamente el robinete para extraer 40 ml del líquido de digestión en una probeta graduada.
8. Dejar sedimentar 10 minutos y aspirar 30 ml del líquido sobrenadante dejando un volumen de 10 ml (sedimento).
9. Verter los 10 ml en una cápsula de Petri.
10. Enjuagar la probeta con aproximadamente 4 ml de agua de canilla y agregarlo a la muestra anterior.
11. Llevar al medio óptico elegido para realizar la lectura y efectuar el conteo de larvas si se presentaren.
Cuantificación de larvas por gramo:
El producto final de la digestión debe observarse inmediatamente después de obtenido.*
De ser positiva la submuestra analizada, se observarán las larvas ya liberadas de su cápsula.
Para expresar el número de larvas por gramo se divide el número de larvas contadas por la cantidad de gramos de muestra analizados.
Nº de L/gr = nº de larvas contadas
peso de la submuestraEn caso de que las larvas sean muy numerosas y entorpezcan el conteo, se vuelca nuevamente el contenido de la placa a la probeta, se homogeiniza, se toma 1 ml se lo lleva a la placa nuevamente y se efectúa el conteo, ESTE PASO DEBE REALIZARSE POR LO MENOS TRES VECES con el fin de obtener un promedio acertado. Este promedio expresará directamente el nº de L/g
* En caso de no examinarse en un período de 30 minutos, deberá clarificarse de la siguiente manera: verter la submuestra en una probeta graduada, resuspender con 30 ml de agua de canilla y dejar sedimentar 10 minutos, quitar 30 ml del líquido sobrenadante a fin de obtener un volumen de 10 ml Si el examen muestra un sedimento poco claro, repetir el proceso de clarificación.
APLICACION EN FRIGORIFICO
La gran ventaja que nos brinda ésta técnica es que nos permite agrupar muestras para diagnosticar en pool.
Por este motivo su utilización es ideal en los establecimientos frigoríficos.
En faena de rutina:
Para carnes porcinas destinadas al consumo se deben tomar submuestras por animal de 5 gramos y agrupar en lotes de 20 animales cada pool. Es conveniente que el pool no supere los 100 grs ya que no resulta adecuado trabajar con mayor cantidad de muestra, pues se requerirá material de vidrio de una capacidad superior, que provoca un manejo dificultoso.
Los lugares y cantidad a muestrear ya fueron mencionados en la página 3.
De acuerdo al total de gramos proceder según la metodología descripta, respentando las proporciones indicadas en la página 6.
En caso de resultar positivo el pool proceder de la siguiente manera: tomar submuestras de 20 grs por animal en pool de 5 y obrar de acuerdo a la técnica descripta . Si uno o más pooles resultaran positivos tomar submuestras de 20 grs de cada animal y aplicar la técnica descripta en forma individual a fin de identificar el o los animales positivos.
En faena de animales provenientes de un foco:
Si los animales provienen de focos de triquinosis se tomarán como mínimo submuestras de 10 grs y pooles de hasta 10 animales a partir de lo cual se realizará la técnica ya descripta. Se sugiere esta cantidad para aumentar la posibilidad de detección de larvas.
NOTIFICACION A LAS AUTORIDADES COMPETENTES
La triquinosis es una enfermedad de denuncia obligatoria según se determina en las siguientes normas legales:
LEY nº 6703/61 de Policia Sanitaria y Fomento Ganadero
Articulo 10º: Declaráse obligatoria la denuncia a las autoridades sanitarias que la reglamentación determine, de cualquier animal atacado de enfermedad transmisible o sospechoso de tenerla, debiendo hacerla efectiva el propietario o persona que a cualquier título se hallare a cargo de la tenencia, explotación o cuidado del mismo. Cuando se tratare de alguna de las enfermedades enumeradas en el articulo 7º, los responsables indicados precedentemente deberán proceder de inmediato a la adopción de medidas de aislamiento y profilaxis, sin perjuicio de la comunicación a las autoridades competentes. Tendrán igual obligación los laboratorios particulares u oficiales y los profesionales veterinarios en general.
LEY Provincial Sanitaria de Carnes n º 11.123
Numeral 9.5.50: Comprobada la presencia del parásito de Trichinella spiralis en cualquier estado en que se halle se decomisará la res.
A fin de cumplimentar la denuncia se adjunta un modelo de Planilla de Denuncia que deberá ser utilizada por todos los laboratorios y frigoríficos. Ante un análisis positivo se remitirá la planilla con la información a las Autoridades Sanitarias Municipales, que serán responsables de su envío a la Dirección de Desarrollo Agropecuario y Sanidad Animal del Ministerio de Asuntos Agrarios.
Sistema de Información
Se organizó como parte del Programa Provincial del Control de la triquinosis un sistema de información que permite el seguimiento y la intervención de los organismos oficiales municipales, provinciales y nacionales ante la aparición de un foco o brote.Los Laboratorios de Control Bromatológico Municipal , de Plantas Faenadoras, Oficiales o Privados y los Veterinarios privados deberán comunicar al representante de la Dirección de Bromatología de su respectivo municipio la detección de un resultado positivo mediante una planilla cuyo modelo se adjunta. El Municipio será responsable de la comunicación a los organismos provinciales y nacionales enviando por faz dicha planilla.
BIBLIOGRAFIA
Resolución Nro:225 / 95. Servicio Nacional de Sanidad Animal.
Ley 6703 / 61 Policía Sanitaria Animal y Fomento Ganadero.
Ley 11123 Provincial Sanitaria de Carnes.
Gamble H. R. Detection of Trichinellosis un Pigs by Artificial Digestion and Enzyme Immunoassay. Journal of Food Protection,Vol 59 Nro.3 1995.
Smith H. J. Comparison of Pepsin -digestion and Enzime-linked Immunosorbent Assay for the Diagnosis of Trichinosis in Swine.1987
Kohler, G. & Ruitenberg, E. J. Comparison of tree methods for the detection of Trichinella spiralis infections in pigs by five European laboratories. 1974.
Trichinellosis. Chapter 3.5.3. O.I.E. Manual 1996.
Código Alimentario Argentino Ley 18284, artículos 247, 248 y 253
Agradecimiento a los Médicos Veterinarios:
Ricardo Caminoa y Ricardo Veneroni que colaboraron en la redacción del presente.
